Apoptosis y necrosis en los órganos circunventriculares después de una hemorragia subaracnoidea experimental detectada con inmunotinción con anexina V y caspasa 3
Objetivos: Los órganos circunventriculares (CVO) son esenciales para la mayoría de las funciones autónomas y endocrinas. Los traumatismos y las hemorragias pueden afectar su función. El objetivo de este estudio fue investigar la apoptosis y necrosis en CVO en el período inicial después de una hemorragia subaracnoidea experimental (HSA) en ratas, utilizando afinidad por anexina V e inmunotinción con caspasa 3.
Métodos: Se utilizaron tres grupos experimentales: los días 1 y 2 después de la HSA, y un grupo control, siete ratas albinas Wistar cada uno. La hemorragia subaracnoidea se logró mediante punción de la arteria basilar transclival. Se perfundió a las ratas con NaCl al 0,9 % y tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4, hasta la parada cardíaca. La apoptosis y la necrosis en CVO se midieron mediante citometría de flujo con tinción con anexina V y mediante inmunotinción con caspasa 3.
Resultados: Apoptosis en el organum vasculosum lamina terminalis (OVLT) , la eminencia media (ME) y el área postrema (AP) fueron significativamente mayores en el grupo del Día 1 que en el grupo de control. La apoptosis en el órgano subfornicial (SFO), OVLT, ME y AP fue significativamente mayor en el grupo del día 2 que en el grupo de control. Hubo diferencias significativas entre los grupos del Día 1 y del Día 2, excepto para AP. La necrosis en SFO y OVLT fue significativamente mayor en el grupo del Día 2 que en el Día 1 o en los grupos de control, mientras que la necrosis en ME y AP no difirió entre los tres grupos. . La densidad celular positiva para caspasa 3 fue más intensa en el grupo del día 2 que en el día 1 y en los grupos de control.
Discusión: La prevención de la apoptosis puede mejorar potencialmente las funciones deterioradas de los CVO después HAS.
Introducción
La apoptosis es la muerte celular programada, que se altera en condiciones patológicas como la hemorragia subaracnoidea (HAS). .1 Se cree que la apoptosis es un factor que contribuye a la patogénesis de la lesión cerebral temprana,2 el vasoespasmo3 y los infartos cerebrales4 observados después de la HSA. En la literatura existen reportes de apoptosis1,2,5,6 y necrosis7,8 luego de HSA, y mejorías de estas luego de la administración de inhibidores de la apoptosis5,6. Los estudios han demostrado d que la inhibición de las vías apoptóticas después de la HSA no solo redujo la muerte celular
sino que también resultó en una mejora significativa en el resultado funcional,2,4 y, por lo tanto, podría haber suprimido muchas de las lesiones secundarias asociadas con SAH.1
Además de muchos centros valiosos del cerebro, también existen varios órganos sensoriales circunventriculares (CVO), como el órgano subfornicial (SFO). , la lámina terminal del órgano vasculoso (OVLT), el área postrema (AP) y la eminencia media (ME, una CVO secretora), están influenciadas por la SAH. strong>9,10 Los órganos circunventriculares son ricos en neurotransmisores y carecen de una barrera hematoencefálica.11,12
Se ha demostrado que la anexina V interactúa fuertemente y específicamente con fosfatidilserina y, por lo tanto, puede usarse para detectar la apoptosis temprana.15 La inmunotinción con caspasa 3 es otro método que se usa actualmente para detectar la apoptosis en muestras de tejido.16
En este estudio, investigamos la presencia de fosfatidilserina temprana y tardía. apoptosis / necrosis por afinidad por anexina V e inmunotinción con caspasa 3 en CVO después de SAH experimental en ratas. En nuestra revisión de la literatura, no pudimos encontrar ningún informe anterior que tratara este tema.
Materiales y métodos
El protocolo del estudio fue aprobado por Bu ¨Comité de Ética Animal de la Universidad Lent Ecevit.
Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Cirugía Experimental, Investigación y Animales de la Universidad Bu¨lent Ecevit, Facultad de Medicina, Zonguldak, Turquía. En total, se incluyeron en el estudio 21 ratas albinas Wistar adultas macho, que pesaban entre 200 y 300 g. Todas las ratas se mantuvieron a 22-25 ºC con humedad adecuada, en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas, y se les administraron líquidos y alimentos ad libitum. Las ratas se dividieron en tres grupos de la siguiente manera: día 1 después de la HSA (n 5 7), día 2 después de la HSA (n 5 7) y controles (n 5 7).
Las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de ketamina (60 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). La HSA experimental se logró con una técnica similar a la descrita por Barry et al.,17 que ya se ha descrito previamente.9,10
Brevemente, se realizó una incisión cervical en la línea media en posición supina, bajo un quirófano. microscopio (Takagi OM-5, Japón), y el clivus se expuso mediante el abordaje parafaríngeo anterior. una ventana huesuda w delante de la arteria basilar se creó utilizando agujas de gran calibre, teniendo mucho cuidado de no abrir la cisterna prepontina. Se insertó una aguja de sutura con un diámetro exterior de 75 mm (Ethicon, Livingston, Reino Unido) en la arteria basilar. La retirada de la aguja provocó una hemorragia extensa en el espacio subaracnoideo, con una distribución uniforme hasta la zona olfatoria. Las ratas se mantuvieron vivas durante 1 y 2 días después de la HSA en condiciones apropiadas.
Las ratas fueron sacrificadas mediante perfusión. Bajo anestesia, se realizó una toracotomía, luego se canuló el ventrículo izquierdo, se pinzaron la aorta descendente, se hizo una incisión en la aurícula derecha y se lavó la sangre de la cabeza y las regiones cervicales con NaCl al 0,9 % y tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). hasta que el corazón se detuvo. Los animales fueron decapitados y se obtuvieron muestras de SFO, OVLT, ME y AP utilizando un atlas estereotáxico de ratas (Paxinos & Watson).
El principio del método de la anexina V .es medir mediante citometría de flujo la afinidad de la anexina V por la fosfatidilserina, que se transloca desde la membrana interna plasmática a la valva externa durante la
apoptosis.15 Se recolectaron células de los distintos CVO s por separado. Utilizamos 100 ml de suspensión celular para cada muestra. Anexina V conjugada con células apoptóticas teñidas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en presencia de yoduro de propidio (PI). Esta reacción permite la detección de fosfatidilserina en la superficie de células apoptóticas. Tanto las células PI positivas como las anexina V positivas indicaron un porcentaje de estado necrótico. Utilizamos un kit comercial anexin-FITC (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y un Coulter FC500 > citómetro de flujo (Beckman-Coulter). En la figura 1 se muestra una presentación esquemática de la pérdida de asimetría lipídica de la membrana durante la apoptosis temprana y la unión específica de la anexina V a la fosfatidilserina. 1. Las células PI positivas y anexina V positivas indican apoptosis o necrosis tardía (Fig. 1).
Para el análisis histopatológico e inmunohistoquímico, CVO Se utilizaron cerebros de ratas obtenidos en todos los grupos. Se fijaron muestras de órganos circunventriculares de cada rata en una solución de formalina neutra al 10% y luego se incluyeron en cera de parafina. Las secciones se cortaron en un criostato a 5-6 mm. espesor Luego, las secciones de tejido se desparafinaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y violeta de cresilo para análisis histomorfológico. Los órganos circunventriculares fueron evaluados bajo microscopía óptica por un único patólogo (FB) que desconocía los grupos de estudio. También se realizó un análisis inmunohistoquímico utilizando el anticuerpo policlonal anticaspasa 3 (CPP32) (Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, EE. UU.) para evaluar la apoptosis. La inmunotinción se basó en la técnica del complejo estreptavidina biotina peroxidasa con recuperación de antígenos de microondas utilizando tejidos incluidos en cera de parafina fijados con formalina. Las secciones incluidas en cera se recogieron en portaobjetos y luego se desparafinaron y rehidrataron. Después de la desparafinación, las secciones se trataron con hidrógeno peroxidasa al 10 % en agua filtrada para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Para la recuperación del antígeno, los portaobjetos se hirvieron con tampón citrato 10 mmol/l (pH 7) durante 10 minutos en un microondas. Luego, los portaobjetos se incubaron con antisueros primarios, incluido el anticuerpo policlonal de conejo caspasa 3 (Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, EE. UU.). Después de lavar en solución salina tamponada con fosfato, los tejidos de los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con biotina, seguido de la incubación en los componentes del sistema de estreptavidina y biotina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las reacciones se hicieron visibles después de la inmersión de las muestras en tetrahidrocloruro de 3,39-diaminobencidina (DAB; Lab Vision, Fremont, CA, EE. UU.). Posteriormente, las secciones se tiñeron con hematoxilina, luego se enjuagaron y se montaron. En el control negativo se omitió el anticuerpo primario y se utilizó tejido de amígdala como control positivo. La inmunorreactividad de caspasa 3 se observó predominantemente en el citoplasma con cierta tinción nuclear. Los portaobjetos fueron evaluados de forma ciega por un único patólogo (FB). La apoptosis, medida por la densidad celular positiva para caspasa 3, se evaluó en los CVO de cada grupo.
Análisis estadístico
El paquete estadístico para ciencias sociales Se utilizó (versión 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, EE. UU.) para todos los análisis de datos. Los resultados se expresaron como mediana y rango. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para las pruebas de normalidad de las variables sin distribución normal y la prueba de Kruskal-Wallis para las comparaciones entre los tres grupos. La prueba de Conover fue Se utiliza para comparaciones post hoc. Para todas las comparaciones estadísticas, se consideró estadísticamente 0,05.
Resultados
Los hallazgos de la citometría de flujo se resumen en la Tabla 1. Gráficos obtenidos de IP/anexina V significativa El análisis de citometría de flujo de SFO, OVLT, ME y AP (grupos de control y del día 2) se muestran en la Fig. 2. En el grupo del día 1, los resultados de apoptosis temprana, mostrados como mediana (rango), fueron los siguientes: OVLT 0,50 % (0,08–1,89), ME 0,55 % (0,21–0,84) y AP 0,46 % (0,20–1,86), apoptosis en la SFO no difirió significativamente de la del grupo de control. Para el grupo del día 2, la apoptosis temprana fue la siguiente: SFO 1,88 % (0,97–2,99), OVLT 1,85 % (0,77–3,16), ME 0,79 % (0,54–1,43) y AP 0,82 % (0,19–1,49 ). ), que fue significativamente mayor en las cuatro áreas que en el grupo de control. En el grupo de control, la apoptosis temprana fue0,12 % (0,02–0,35) en el SFO, 0,15 % (0,04–0,71) en el OVLT, 0,18 % (0,09–0,34) > en el ME, y 0,06 % (0,01–0,24) en el AP.
Necrosis en el SFO y OVLT en el grupo del Día 2 fue significativamente mayor que en los grupos del Día 1 y de control, y los resultados para el ME y el AP no difirió entre los grupos del día 1 y de control
El examen histopatológico de las secciones SFO, OVLT, ME y AP mostró una pérdida celular más prominente en el grupo del día 2 que en el grupo del día 2. los otros grupos.
La densidad celular positiva para caspasa 3 fue más intensa en el grupo del día 2 que en los otros dos grupos. Había pocas células caspasa 3 positivas en el grupo de control, y el grupo del día 1 tenía menos células caspasa 3 positivas que el grupo del día 2.
Discusión
La apoptosis es uno de los mecanismos en la evolución de la muerte celular, que puede observarse después de una HSA clínica y experimental.
En este estudio de CVO Después de la SAH experimental en ratas, se observó apoptosis en SFO, OVLT, AP y ME. En el grupo de estudio del día 1, encontramos una mayor afinidad de la anexina V por la fosfatidilserina (apoptosis temprana) en todos los CVO excepto en el SFO. En el día 2 g
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